Cucurbituryls stabilizują leki imidazolinowe molekularnie

Czy supramolekularna chemia zmienia oblicze terapii?

Chemia supramolekularna zyskała w ostatnich dekadach ogromne znaczenie badawcze, szczególnie w kontekście tworzenia kompleksów typu gospodarz-gość za pomocą oddziaływań niekowalencyjnych. Oddziaływania te, obejmujące wiązania wodorowe, oddziaływania π-π, siły elektrostatyczne, siły van der Waalsa oraz przyciąganie hydrofobowe/hydrofilowe, doprowadziły do odrodzenia zainteresowania strukturami supramolekularnymi. W przeciwieństwie do złożonych syntez chemicznych, tworzenie takich kompleksów charakteryzuje się prostymi i ekonomicznymi metodami preparatyki, bez konieczności skomplikowanych etapów syntezy i oczyszczania. Dodatkowo, struktury supramolekularne mogą być wytwarzane w warunkach otoczenia, co czyni je przyjaznymi dla środowiska.

Wśród wielu badanych makrocyklicznych cząsteczek, cucurbituril[n]e (n = 5-8, 10) charakteryzują się hydrofobową wnęką dostępną przez dwa portale zawierające grupy karbonylowe, które umożliwiają tworzenie kompleksów inkluzyjnych poprzez kombinację oddziaływań jon-dipol, wiązań wodorowych i oddziaływań hydrofobowych. Prosta synteza z tanich materiałów wyjściowych, w połączeniu z wysoką stabilnością chemiczną i termiczną oraz niską toksycznością, czyni je atrakcyjnymi jako receptory do rozpoznawania molekularnego i budowania materiałów supramolekularnych. Badanie interakcji między cucurbiturylami a różnymi biomolekułami jest kluczowe dla rozwoju nowych materiałów funkcjonalnych, selektywnych czujników i leków, a także kontrolowanego uwalniania agrochemikaliów i efektywnych systemów dostarczania leków.

Czy leki imidazolinowe mogą stać się bardziej efektywne?

Farmaceutyki imidazolinowe, takie jak oksymetazolina (OXY) i ksylometazolina (XYL), są sympatykomimetycznymi wazokonstrytorami tętniczek ocznych lub nosowych. Te leki charakteryzują się rdzeniem aromatycznym i grupą boczną imidazolinową, są powszechnie stosowane do przekrwienia nosa i oczu oraz wazokonstrykcji. Mechanizm działania tych związków polega na oddziaływaniu na receptory adrenergiczne α1 i α2, co skutkuje przewagą stymulacji adrenergicznej α1. Związki te nie są zalecane do przyjmowania doustnego ze względu na ich toksyczność. Ze względu na ich lipofilność przenikają przez śluz nosowy, by wywrzeć swój efekt. Z drugiej strony, w roztworze istnieją jako kationowe jony imidazoliowe, z wartością pKa w zakresie 8,5-10,5. Te cechy strukturalne kwalifikują te związki jako odpowiednich gości do włączenia do cucurbituril[n]ów o większej wnęce, takich jak CB[7] i CB[8].

Wcześniejsze badania kompleksów inkluzyjnych niektórych leków imidazolinowych z β-cyklodekstryną (β-CD) wykazały, że tworzenie kompleksu 1:1 między gościem a gospodarzem potwierdzone za pomocą miareczkowania fluorescencyjnego znacząco zwiększa stabilność fotochemiczną w porównaniu do wolnych leków, co wydłuża ich okres przydatności. Podobnie, antybiotyk ciprofloksacyna tworzy stabilny kompleks z makrocyklicznym gospodarzem CB[7], co zwiększa fotostabilność leku w formulacjach i systemach dostarczania leków. Kompleksy inkluzyjne mogą stać się bardziej rozpuszczalne, biodostępne i bardziej odporne na warunki metaboliczne w porównaniu do indywidualnych, nieskompleksowanych cząsteczek.

Jakie metody badawcze wykorzystujemy do analizy kompleksów?

W niniejszej pracy przedstawiamy badanie kompleksowania inkluzyjnego dwóch leków imidazolinowych, OXY i XYL, z cucurbituril[n]ami (n = 7, 8). Wykazujemy przygotowanie i charakterystykę kompleksów inkluzyjnych tych dwóch strukturalnie podobnych gości z CB[7] i CB[8]. Naszym celem jest ustanowienie podstawowych wyników, które posłużą jako fundament dla przyszłych badań nad strategiami formulacji tych leków, ostatecznie prowadząc do leków o zwiększonej biodostępności i dłuższym okresie trwałości. Dodatkowo, przedstawiamy wykorzystanie symulacji dynamiki molekularnej (MD) i obliczeń DFT do badania mechanizmów interakcji między tymi gośćmi a gospodarzami oraz do oceny różnic strukturalnych w stabilności kompleksów.

Wszystkie substancje chemiczne wykorzystane w tym badaniu uzyskano od Sigma-Aldrich. Do przygotowania wszystkich roztworów użyto ultraczystej wody. CB[n] zsyntezowano przy użyciu tej samej metody opisanej w literaturze, z pewnymi modyfikacjami. Wytworzono mieszaninę CB[n], którą następnie rozdzielono poprzez krystalizację frakcyjną na podstawie różnic w rozpuszczalności w różnych rozpuszczalnikach.

Kompleksy w stanie stałym przygotowano poprzez liofilizację mieszaniny gospodarzy i gości w stosunku molowym 1:1. Odpowiednią ilość każdego z CB[7] i CB[8], wraz z 25 mg gościa (OXY i XYL), rozpuszczono w odpowiedniej ilości dejonizowanej wody. Mieszaniny umieszczono w wytrząsarce inkubacyjnej i inkubowano przez 48 godzin w temperaturze 40°C. Roztwory kompleksów inkluzyjnych zamrożono na noc w zamrażarce ultraniskiej temperatury w -70°C, a następnie suszono w liofilizatorze przez 48 godzin.

Jakie są kluczowe przemiany spektroskopowe w kompleksowaniu?

Badania spektroskopii fluorescencyjnej wykazały, że OXY i XYL wykazują słabe widma fluorescencyjne w wodzie z pikiem przy 365 nm przy wzbudzeniu przy 285 nm. Wraz ze stopniowym dodawaniem CB[7], intensywność fluorescencji tego piku wzrasta, a nowy pik pojawia się przy 420 nm, który również znacząco rośnie przy wyższych stężeniach CB[7]. Zamknięcie leku w hydrofobowej wnęce CB[n] zwiększa fluorescencję poprzez ograniczenie ruchu cząsteczek gościa w stanie wzbudzonym. W przypadku kompleksów CB[7], interakcja jon-dipol między grupami karbonylowymi przy portalu a grupą imidazoliową jest niezbędna do stabilizacji stanu wzbudzonego, powodując batochromowe przesunięcie pasma fluorescencji. Efekt ten nie jest obserwowany w CB[8] ze względu na większą odległość między grupą imidazoliową a grupami karbonylowymi.

Spektrometria mas z jonizacją elektrorozpyłową (ESI-MS) i spektrometria mas MALDI-TOF potwierdziły tworzenie kompleksów 1:1 między dwoma gośćmi a dwoma gospodarzami. Piki jonowe [OXY CB[7] + H]⁺ i [2OXY @CB[7]+2H]²⁺ są obserwowane odpowiednio przy m/z 1424,9 i 842,8. Z drugiej strony, widmo ESI-MS kompleksu inkluzyjnego OXY z CB[8] pokazuje piki jonów pojedynczo naładowanych odpowiadające [OXY @CB[8]+H]⁺ przy m/z 1590,10. Podobne wyniki zaobserwowano w widmie ESI-MS XYL z CB[7], gdzie piki jonowe przy m/z 1408,10 i 848,50 reprezentują odpowiednio [XYL @CB[7]+H]⁺ i [2XYL @CB[7]+2Na]²⁺.

Co mówi analiza NMR o interakcjach molekularnych?

Spektroskopia ¹H NMR dostarcza cennych informacji o interakcji między gośćmi a gospodarzami. W przeciwieństwie do cyklodekstryn, cucurbituril nie posiada protonów w swojej wnęce; dlatego rezonanse protonowe cząsteczki gościa oferują istotne informacje o potencjalnej pozycji gościa we wnęce gospodarza. Wiadomo, że protony gościa znajdujące się w regionie ekranowania wnęki doświadczają przesunięć w górę pola (Δδ < 0; Δδ = δ_związany – δ_wolny), podczas gdy protony gościa odsłonięte przy tlenach karbonylowych portali przechodzą przesunięcia w dół pola (Δδ > 0). Widma ¹H NMR OXY i OXY@CB[7] wykazują jedynie niewielkie przesunięcie w górę pola sygnałów dla grupy t-butylowej (H1) i protonu aromatycznego (H5). Z kolei niewielkie przesunięcie w dół pola obserwuje się dla grup metylowych fenolu (H2) i grupy metylenowej łączącej dwa pierścienie.

Obserwowano przesunięcie w górę pola sygnałów wszystkich protonów OXY@CB[8] w porównaniu do wolnego gościa. Maksymalne przesunięcie zaobserwowano dla protonu aromatycznego (ΔδH5, -0,024 ppm), a następnie dla metylu (ΔδH2, -0,022 ppm) i metylenu (ΔδH3, 0,019 ppm). Podobne wyniki zaobserwowano dla kompleksów XYL z CB[7] i CB[8]. Z tych wyników wnioskujemy, że goście wprowadzają tylko grupę t-butylową do wnęki dwóch gospodarzy, podczas gdy CB[8] dodatkowo włącza H5 do swojej wnęki. Jednocześnie reszta cząsteczki pozostaje poza gospodarzem ze względu na przeszkodę steryczną spowodowaną przez dwie grupy metylowe w pozycji meta. Duży rozmiar CB[8] pozwala na wprowadzenie objętościowych gości do jego wnęki.

Co ciekawe, widma ¹H NMR obu gości z CB[8] pokazują dodatkowy pik przesunięty w dół pola, przypisany protonom NH imidazoliowym. Ten pik nie był obserwowany w widmach czystych gości lub ich kompleksów z CB[7] ze względu na szybką wymianę H/D w D₂O. Pojawienie się tego sygnału w obecności CB[8] jest interpretowane jako wynik niższej szybkości wymiany H/D wynikającej z zaangażowania tej grupy w kompleksowanie z CB[8].

Czy badania termiczne potwierdzają stabilność kompleksów?

Badania dyfrakcji rentgenowskiej na proszku (PXRD) i analizy termograwimetrycznej (TGA) potwierdziły tworzenie stabilnych kompleksów między OXY/XYL a dwoma gospodarzami. Wzory PXRD fizycznych mieszanin i kompleksów inkluzyjnych są porównywane z wzorami czystego gościa i gospodarza. Mieszaniny fizyczne gości z CB[7] i CB[8] pokazują nakładające się wzory odbić gościa i gospodarza. Jest to dobrze zilustrowane w przypadku krystalicznego gospodarza, CB[8], gdzie odbicia zarówno gospodarza, jak i gościa są obserwowane we wzorach PM.

Analiza różnicowej kalorymetrii skaningowej (DSC) wykazała, że enkapsulacja tych leków imidazolinowych we wnęce gospodarzy cucurbiturylowych nadaje większą stabilność termiczną skompleksowanemu lekowi w porównaniu do czystej formy. Krzywa DSC OXY pokazuje ostry pik endotermiczny w okolicach 310°C, sugerujący jego temperaturę topnienia (301,5°C) i krystaliczną naturę. Jak oczekiwano, CB[7] wykazuje pik endotermiczny przy 87°C odpowiadający usunięciu wody z cavitandu oraz pik endotermiczno-egzotermiczny przy 382 i 420°C przypisany topieniu, a następnie rozkładowi związku. Jednak dla kompleksu OXY@CB[7] ostry pik endotermiczny, który pojawił się w okolicach ~310°C dla OXY, zniknął, a obserwowany jest szeroki pik egzotermiczny przy 397°C, wskazujący na rozkład kompleksu.

Dlatego enkapsulacja w nanoukrywach takich cavitandów pozwoliłaby na ogrzewanie skompleksowanych form do temperatur do 250°C w celu suszenia podczas przygotowywania formulacji tych związków, co zwiększyłoby ich stabilność podczas przechowywania.

Jak teoretyczne symulacje uzupełniają dane eksperymentalne?

Symulacje dynamiki molekularnej (MD) kompleksów OXY i XYL z obydwoma gospodarzami w środowisku wodnym wykazały, że grupa t-butylowa i część pierścienia aromatycznego są wprowadzane do wnęki CB[7], podczas gdy grupa imidazolinowa pozostaje poza wnęką. Wyniki symulacji wskazują, że dwaj goście wchodzą głębiej do wnęki CB[8], co potwierdza wyniki ¹H NMR. Analizując interakcje wiązań wodorowych między gospodarzami a gośćmi w trakcie symulacji, wywnioskowano, że oprócz oddziaływań van der Waalsa i oddziaływań jon-dipol, wiązania wodorowe również przyczyniają się do stabilności tych kompleksów.

Enkapsulacja organicznych cząsteczek gościa do nanoukrywy jest stabilizowana przez interakcję cząsteczek gościa z gospodarzem poprzez różne siły, w tym interakcje jon-dipol, interakcje dipol-dipol, siły van der Waalsa, interakcje hydrofobowe i wiązania wodorowe. Dwie cząsteczki gościa posiadają grupy donorowe protonów (NH i OH) zdolne do interakcji z grupami karbonylowymi ureido. Z analizy funkcji rozkładu radialnego (RDF) wynika, że wolny OXY w wodzie wykazuje ostry pik z maksimami przy 1,85 Å i 1,92 Å odpowiednio dla grup NH i OH. Oba piki są następnie następowane przez minimum w okolicach 2,5 Å. Te sygnały odpowiadają pierwszej powłoce hydratacyjnej, reprezentującej silne wiązanie wodorowe między grupami imidazolowymi i hydroksylowymi gościa a wodą.

Energie wiązania obliczone za pomocą metody DFT/B97X-D/6-31G(d) na kompleksach w fazie gazowej potwierdzają ich stabilność. Wysokie wartości zmiany entalpii (ΔH) dla wszystkich kompleksów sugerują proces napędzany entalpią, zdominowany przez oddziaływania van der Waalsa. Negatywne i znaczące wartości energii swobodnej Gibbsa (ΔG) wskazują, że proces kompleksowania jest spontaniczny. Obliczenia termodynamiczne przeprowadzono w temperaturze 298,15 K i ciśnieniu 1 atm dla wszystkich kompleksów.

Aby uzyskać dalszy wgląd w interakcje między OXY i XYL a dwoma gospodarzami, użyto kwantowej teorii atomów w cząsteczkach (QTAIM) do zbadania właściwości topologicznych tych kompleksów. W QTAIM analiza topologiczna gęstości ładunku elektronowego (ρ(r)) i jej laplasjanu (∇²ρ(r)) w krytycznych punktach wiązania (BCP) jest używana do charakteryzacji wiązań lub interakcji. Wartość gęstości elektronowej zwykle określa siłę wiązania. Z drugiej strony, laplasjan ρ(r) (∇²ρ) w BCP pomaga scharakteryzować naturę wiązania lub interakcji na podstawie informacji o koncentracji lub zubożeniu ładunku w BCP.

Jak wyniki badań wpływają na nowoczesną praktykę kliniczną?

Tworzenie kompleksów inkluzyjnych między OXY i XYL z CB[7] i CB[8] dostarcza podstawowych informacji dla przyszłego rozwoju formulacji leków i sugeruje, że te kompleksy mogłyby skutecznie chronić te związki przed czynnikami środowiskowymi, takimi jak temperatura, zwiększając tym samym ich okres trwałości. Te wyniki mają istotne implikacje kliniczne, gdyż mogą prowadzić do rozwoju formulacji farmaceutycznych o zwiększonej stabilności, wydłużonym okresie przydatności i potencjalnie lepszej biodostępności, co przekłada się na skuteczniejszą terapię dla pacjentów.

Podsumowanie

Chemia supramolekularna, oparta na oddziaływaniach niekowalencyjnych, otwiera nowe możliwości w farmacji dzięki tworzeniu kompleksów typu gospodarz-gość. Badania nad kompleksowaniem leków imidazolinowych – oksymetazoliny i ksylometazoliny – z makrocyklicznymi cząsteczkami cucurbituril[7] i cucurbituril[8] wykazały, że enkapsulacja tych substancji we wnękach molekularnych znacząco zwiększa ich stabilność termiczną i fotochemiczną. Wykorzystując zaawansowane metody analityczne, w tym spektroskopię fluorescencyjną, spektrometrię mas, spektroskopię NMR oraz analizy termiczne, potwierdzono tworzenie stabilnych kompleksów w stosunku 1:1. Badania ujawniły, że grupa t-butylowa leku wprowadzana jest do wnęki gospodarza, podczas gdy większa wnęka CB[8] umożliwia głębszą penetrację cząsteczki gościa. Symulacje dynamiki molekularnej i obliczenia DFT potwierdziły, że stabilność kompleksów wynika z kombinacji oddziaływań van der Waalsa, wiązań wodorowych i interakcji jon-dipol. Analiza termograwimetryczna wykazała, że skompleksowane formy leków można bezpiecznie ogrzewać do 250°C bez utraty stabilności, co jest niemożliwe dla czystych substancji. Te odkrycia mają bezpośrednie zastosowanie kliniczne, ponieważ mogą prowadzić do opracowania formulacji farmaceutycznych o przedłużonym okresie przydatności, zwiększonej biodostępności i lepszej odporności na warunki metaboliczne, co ostatecznie przekłada się na skuteczniejszą terapię dla pacjentów stosujących leki wazokonstrykacyjne.